MNK Wyspiański to oddział poświęcony jednemu z najwybitniejszych twórców polskiej sztuki – Stanisławowi Wyspiańskiemu. Muzeum posiada największą na świecie kolekcję jego dzieł; w oddziale znajduje się ich blisko 200, w tym liczne pastele szczególnie wrażliwe na światło i warunki otoczenia. Z tego względu ekspozycja jest cyklicznie zmieniana, aby zapewnić pracom odpowiednie warunki konserwatorskie. Prezentowana kolekcja obejmuje malarstwo portretowe i pejzażowe, a także zespół projektów dekoracyjnych do kościoła Franciszkanów w Krakowie, katedr – lwowskiej i wawelskiej oraz Domu Towarzystwa Lekarskiego w Krakowie. W skład zbiorów wchodzą również rysunki ołówkowe, akwarele i malarstwo olejne oraz projekty witraży i polichromii, ukazujące wszechstronność artysty.